SU-100 được sử dụng rộng rãi trong những năm cuối cùng của cuộc chiến tranh vệ quốc vĩ đại. Nó được sử dụng với số lượng lớn tại Hungary vào tháng 3 năm 1945, khi Hồng quân Xô Viết đánh tan các đợt tấn công của phát xít Đức trong Chiến dịch Thức tỉnh Mùa xuân tại hồ Balaton.Tính đến tháng 7 năm 1945, 2.335 chiếc SU-100 đã được chế tạo.

Đối thủ của Su-100 bên phía Đức là Jagdpanzer IV và Jagdpanther. Khi so sánh với Jagdpanzer IV,Su-100 vượt trội ở mọi thông số,từ vỏ giáp,hỏa lực cho tới tầm hoạt động.Còn nếu so với Jagdpanther (loại pháo tự hành chống tăng tốt nhất của Đức quốc xã trong Thế chiến 2) thì có thể kết luận như sau:

• Giáp trước của hai loại xe tương đương nhau trong khi Su-100 nhẹ hơn nhiều (30 tấn so với 45,5 tấn)
• Pháo 88mm L/71 của Jagdpanther và 100mm L/53 của Su-100 có sức xuyên tương đương nhau. Tuy nhiên, pháo 100mm bắn đạn nổ chống công sự và bộ binh mạnh hơn 50% so với 88mm L/71;
• Jagdpanther mang được nhiều đạn pháo hơn (57 viên so với 33 viên);
• Tầm hoạt động của Su-100 vượt trội hơn hẳn (300km so với 160km);
• Kính ngắm của hai loại xe có chất lượng tương đương nhau,tuy nhiên nóc của SU-100 có vòm quan sát dành cho chỉ huy mà Jagdpanther lại không có,nên SU-100 có khả năng quan sát chiến trường tốt hơn.
• Su-100 sử dụng khung thân của T-34 nên dễ sửa chữa hơn nhiều so với Jagdpanther (dùng khung thân của xe tăng Panther)
• Su-100 có giá thành rẻ và dễ chế tạo hơn nhiều so với Jagapanther, đã có tới trên 2.300 chiếc Su-100 được chế tạo so với chỉ 415 chiếc Jagapanther.

Nhìn chung, Su-100 vượt trội hơn ở 5 thông số (hỏa lực, khối lượng, độ bền,chi phí và tầm hoạt động),tương đương ở 1 thông số (vỏ giáp) và chỉ kém hơn 1 thông số (số lượng đạn mang theo).

SU-100 vẫn tiếp tục được Hồng quân Liên Xô sử dụng sau chiến tranh, việc sản xuất kéo dài đến năm 1947 ở Liên Xô và 1950 ở Tiệp Khắc. SU-100 được Hồng quân Xô Viết cho "nghỉ hưu" vào năm 1957 nhưng vẫn ở lại trong kho làm lực lượng dự phòng; nhiều chiếc SU-100 vẫn tồn tại trong các kho dự phòng cho đến ngày nay.

Nhiều quốc gia thuộc khối Warszawa và các đồng minh khác của Liên Xô như Ai Cập, Angola và Cuba tiếp tục sử dụng SU-100.SU-100 từng tham chiến trong cuộc Khủng hoảng Kênh đào Suez năm 1956 khi quân Ai Cập dùng nó để đối đầu với xe tăng M4 Sherman của Israel. Sau đó SU-100 cũng tham chiến trong Chiến tranh Ả Rập-Israel lần thứ ba (1967) và Chiến tranh Ả Rập-Israel lần thứ tư (1973). Nó được chỉnh sửa một chút để phù hợp với điều kiện sa mạc và vì vậy trở thành phiên bản SU-100M. Các phiên bản xuất khẩu của SU-100 tiếp tục được sử dụng cho đến năm 1970,thậm chí là tới tận ngày nay. Quân đội Nhân dân Việt Nam và Lục quân Nhân dân Triều Tiên vẫn tiếp tục sử dụng SU-100 dù quan điểm tác chiến thiết giáp hiện đại trên thế giới đã phát triển. SU-100 tỏ ra đã lỗi thời trước các thiết kế pháo tự hành chống tăng và lựu pháo tự hành hoàn toàn hoạt động độc lập, xoay được 360° ở cả thân xe.

SU-100 trở thành một phần của Quân Giải phóng Nhân dân Trung Hoa năm 1955 khi Hồng quân Xô Viết rút quân khỏi Đại Liên. Tất cả những khí tài quân sự của Liên Xô tại Đại Liên đều được bán cho CHND Trung Hoa, cụ thể là 99 pháo tự hành SU-100, 18 xe tăng hạng nặng IS-2, 16 xe tăng T-54 và 224 xe tăng T-34. Những khí tài này được CHND Trung Hoa dùng để cấu trúc lập nên Sư đoàn cơ giới số 1.